3 Mga Paraan Upang Gawin ang Paraan ng Gram ng Paglamlam

2024 May -akda: Jason Gerald | [email protected]. Huling binago: 2023-12-16 11:43

Ang paglamlam ng Gram ay isang mabilis na pamamaraan at ginagamit upang makita ang pagkakaroon ng bakterya sa isang sample ng tisyu at iuri ang mga bakterya bilang Gram-positibo o Gram-negatibo, batay sa kemikal at pisikal na mga katangian ng kanilang mga dingding ng cell. Ang mantsang Gram ay halos palaging ginagamit bilang unang hakbang sa pag-diagnose ng impeksyon sa bakterya.

Ang diskarteng ito ng paglamlam ay pinangalanan pagkatapos ng siyentipikong taga-Denmark na si Hans Christian Gram (1853 - 1938), na bumuo ng pamamaraan noong 1882 at inilathala ito noong 1884 bilang isang pamamaraan para makilala ang pagitan ng dalawang uri ng bakterya na may katulad na mga klinikal na sintomas: Streptococcus pneumoniae (kilala rin bilang Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) at ang bakterya na Klebsiella pneumoniae.

Hakbang

Paraan 1 ng 3: Paghahanda ng Slide ng Mikroskopyo

Hakbang 1. Maghanda upang magtrabaho sa laboratoryo

Magsuot ng guwantes at isang mahabang kurbatang buhok upang maiwasan ang kontaminasyon ng bakterya ng sample na iyong sinusubukan. Linisin ang workspace sa ilalim ng fume hood, o sa isa pang mahusay na maaliwalas na lugar. Suriin ang Bunsen burner at tiyaking gumagana nang maayos ang microscope bago ka magsimula.

Hakbang 2. Isteriliser ang slide ng salamin sa microscope

Kung marumi ang slide ng baso, hugasan ito ng tubig na may sabon upang matanggal ang langis at dumi. Linisin ang mga slide gamit ang ethanol, glass cleaner, o ibang pamamaraan na ginamit ng iyong laboratoryo.

Hakbang 3. Ilagay ang sample sa slide ng salamin

Maaari mong gamitin ang diskarteng Gram stain upang makatulong na makilala ang mga bakterya sa isang medikal na sample, o isang kultura ng bakterya na lumalaki sa isang petri dish. Para sa pinakamahusay na mga resulta, gumamit ng Gram stain sa manipis na mga stroke ng sample. Maipapayo na gumamit ng mga sample na wala pang 24 na oras ang edad, dahil maaaring masira ng mas matandang bakterya ang kanilang mga pader sa cell at maaaring hindi tumugon sa paglamlam ng Gram.

Kung gumagamit ng isang sample ng tisyu, magdagdag ng 1-2 patak sa isang slide ng baso. Magkalat nang pantay sa slide upang makabuo ng isang manipis na layer ng sample ng pagwiwisik, sa pamamagitan ng pag-slide ito gamit ang gilid ng iba pang sterile glass slide. Hayaan itong matuyo bago gawin ang susunod na hakbang.
Kung kumukuha ka ng mga bakterya mula sa isang petri dish, isteriliser ang inoculation loop sa isang Bunsen burner hanggang sa mamula ito, pagkatapos ay payagan itong palamig. Gumamit ng loop upang magtulo ng sterile water papunta sa slide, pagkatapos ay isteriliser at cool muli bago gamitin ito upang mangolekta ng isang maliit na sample ng bakterya. Pagkatapos nito ay gumalaw ng marahan.
Ang mga bakterya na inihanda sa sabaw ay dapat na hinalo muli gamit ang isang vortexer, pagkatapos ay kinuha gamit ang inoculation loop tulad ng nasa itaas, nang hindi nagdaragdag ng tubig.
Kung mayroon kang isang sample ng pamunas (karaniwang ginagawa gamit ang isang maliit na hawakan ng cotton-tipped), hawakan at dahan-dahang paikutin ang pamunas sa slide.

Hakbang 4. Ang isang bahagyang mataas na temperatura ay maaaring gumawa ng isang mahusay na pahid

Hawak ng init ang mga bakterya sa tuktok ng slide, kaya't hindi sila madaling matunaw sa panahon ng proseso ng paglamlam. Mabilis na i-tap ang slide ng dalawa hanggang tatlong beses sa isang Bunsen burner, o painitin ang slide sa isang electric slide heater. Huwag mag-init ng sobra, maaaring nasira ang sample. Kung gumagamit ka ng isang Bunsen burner, dapat itong isang maliit ngunit asul na apoy sa halip na isang malaking kulay-kahel na apoy.

Bilang kahalili, ang isang pahid ay maaari ding gawin sa methanol, sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 1-2 patak ng methanol sa isang tuyo na pahid, pagpapatayo ng natitirang methanol sa slide sa pamamagitan ng pag-iwan sa bukas na hangin. Pinapaliit ng pamamaraang ito ang pinsala ng cell at nagbibigay ng malinis na background ng imahe ng slide

Hakbang 5. Iposisyon ang slide sa ibabaw ng tray ng pangkulay

Ang mga stenting tray ay gawa sa metal, baso, o mababaw na mga plato ng plastik na may malambot na mata na lining sa tuktok. Ilagay ang mga slide sa tuktok ng mga lambat na ito, upang ang likidong ginamit mo ay maaring maubos sa tray.

Kung wala kang isang tray ng pangkulay, maaari kang maglagay ng isang slide sa isang plastic tray upang mag-print ng mga ice cubes

Paraan 2 ng 3: Proseso ng Gram Stain

Hakbang 1. Ibuhos ang kristal na violet na likido sa smear

Gumamit ng isang pipette upang magwilig ng isang sample ng bakterya na may ilang patak ng kristal na lila na tina, na kilala rin bilang gentian violet. Iwanan ito sa loob ng 30-60 segundo. Ang Crystal violet (KV) ay naghihiwalay sa may tubig na solusyon sa mga KV + at chloride (Cl-) na mga ions. Ang mga ion na ito ay tumagos sa mga dingding ng cell at mga lamad ng cell ng parehong gramo na positibo at gramo-negatibong bakterya. Nakikipag-ugnay ang KV + ion sa mga negatibong sisingilin na sangkap ng mga bacterial cell, na nagbibigay sa mga cell ng isang lilang kulay.

Maraming mga laboratoryo ang gumagamit ng "Hucker" na kristal na lila, na naglalaman ng ammonium oxalate upang maiwasan ang pag-ulan

Hakbang 2. Banayad na banayad ang Crystal violet

Ikiling ang slide at gumamit ng isang bote ng washer upang magwilig ng isang maliit na daloy ng dalisay o i-tap ang tubig sa slide. Ang tubig ay dapat na tumakbo pababa sa ibabaw ng smear, at hindi dapat direktang spray sa smear. Huwag banlawan nang labis. Maaari nitong alisin ang paglamlam sa Gram positibong bakterya.

Hakbang 3. I-flush ang pahid ng yodo, pagkatapos ay banlawan

Gumamit ng isang dropper upang mapula ang pahid sa yodo. Iwanan ito nang hindi bababa sa 60 segundo, pagkatapos ay banlawan nang maingat sa parehong paraan tulad ng nasa itaas. Ang yodo, sa anyo ng isang negatibong singil na ion, nakikipag-ugnay sa KV + upang mabuo ang isang malaking compound complex sa pagitan ng Crystal violet at iodine (CV-I compound complex) sa panloob at panlabas na mga layer ng cell. Ang kumplikadong mga compound na ito ay mananatili sa kulay-lila na kulay ng kristal na lila sa loob ng cell, sa mga namantsang lokasyon.

Ang yodo ay isang kinakaing unos. Iwasan ang paglanghap, paglunok o pakikipag-ugnay sa balat

Hakbang 4. Magdagdag ng kulay na pampaputi, pagkatapos ay banlawan nang mabilis

Ang isang 1: 1 timpla ng acetone at etanol ay karaniwang ginagamit para sa mahalagang hakbang na ito, na dapat maingat na mag-time. Iposisyon ang slide sa isang tiyak na anggulo, pagkatapos ay magdagdag ng kulay na pagpapaputi hanggang sa hindi na makita ang lilang sa tubig na ginamit para sa banlaw. Karaniwan itong tumatagal ng mas mababa sa 10 segundo, o kahit na mas kaunting oras kung ang pagpapaputi ay naglalaman ng isang mataas na konsentrasyon ng acetone. Itigil kaagad ang hakbang na ito, kung hindi man ang tinain ay maglalabas din ng kristal na lila mula sa mga positibong gramo at negatibong mga selula, at ang proseso ng paglamlam ay dapat na ulitin. Agad na banlawan ang anumang labis na pagpapaputi ng kulay gamit ang nakaraang pamamaraan.

Ang purong acetone (95% +) ay maaaring gamitin bilang pamalit. Ang mas maraming acetone na iyong ginagamit, mas mabilis ang paggana ng pagpapaputi kaya kailangan mong bigyang pansin ang oras.
Kung nagkakaproblema ka sa pagsubaybay sa oras para sa hakbang na ito, magdagdag ng drop-drop ng drop-drop ng kulay.

Hakbang 5. Budburan ang counter-dye sa smear, pagkatapos ay banlawan

Ang isang counter stain, karaniwang safranin o fuchsin, ay ginagamit upang madagdagan ang pagkakaiba sa pagitan ng gram-negatibo at gram-positibong bakterya, sa pamamagitan ng paglamlam ng mga decolorized (decolorized) na bakterya, ibig sabihin, gram-negatibong bakterya, rosas o pula. Mag-iwan ng hindi bababa sa 45 segundo, pagkatapos ay banlawan.

Ang Fuchsin ay mahigpit na mantsan ng maraming mga bakterya na negatibo sa gramo, tulad ng Haemophilus spp at Legionella spp. Ang pamamaraang ito ay mabuti para sa mga nagsisimula

Hakbang 6. Patuyuin ang slide

Maaari mong patuyuin ang mga ito sa bukas na hangin upang matuyo, o matuyo sila gamit ang biblikal na papel na ipinagbibili para sa layuning ito. Kumpleto ang proseso ng paglamlam sa Gram.

Paraan 3 ng 3: Sinusuri ang Mga Resulta sa Pangkulay

Hakbang 1. Ihanda ang ilaw na mikroskopyo

Ilagay ang slide sa ilalim ng mikroskopyo. Ang bakterya ay malaki ang pagkakaiba-iba sa laki, kaya't ang kabuuang kinakailangang pagpapalaki ay mag-iiba mula 400x hanggang 1000x. Inirerekomenda ang isang layunin na lente na may langis ng paglulubog para sa isang mas matalas na imahe. I-drop ang immersion oil sa slide, pag-iwas sa paggalaw habang tumutulo upang maiwasan ang pagbuo ng mga bula. Ilipat ang hawakan ng lens ng microscope upang ang layunin ng lens ay pumutok at mahipo ang langis.

Ang paglulubog ng langis ay maaari lamang magamit sa mga espesyal na dinisenyo na lente, hindi sa mga "tuyong" lente

Hakbang 2. Subukang kilalanin ang positibo na gramo ng gramo at negatibong bakterya

Suriin ang slide sa ilalim ng isang ilaw na mikroskopyo. Ang mga bakterya na positibo sa gramo ay lilitaw na kulay-ube, dahil ang kristal na lila ay nakulong sa loob ng makapal na dingding ng cell. Ang mga bakterya na negatibo sa Gram ay magiging kulay-rosas o pula ang kulay, sapagkat ang kristal na bayolet ay hugasan sa manipis na mga dingding ng cell, kung saan pumapasok ang rosas na counter-dye.

Kung ang sample ay masyadong makapal, ang resulta ay maaaring isang maling positibo. Pantsahan ang isang bagong sample kung nagpapakita ito ng lahat ng positibong bakterya ng gramo, upang matiyak na ang resulta ay tama.
Kung gumamit ka ng labis na pagpapaputi ng kulay, ang resulta ay maaaring isang maling negatibo. Pantsahan ang isang bagong sample kung ipinapakita nito ang lahat ng negatibong bakterya ng gramo, upang matiyak na ang resulta ay tama.

Hakbang 3. Ihambing ang mga resulta na nakikita mo sa sangguniang imahe

Kung hindi mo alam kung ano ang hitsura ng bakterya, pag-aralan ang koleksyon ng mga sanggunian na imahe, karaniwang pinagsunod-sunod ayon sa hugis at mantsa ng Gram. Maaari mo ring tingnan ang mga online na database sa [National Microbial Pathogen Database, Bacteria sa Mga Larawan, at maraming iba pang mga online site. Upang mapadali ang pagkakakilanlan, sa ibaba ay mga halimbawa ng bakterya na karaniwang nakatagpo o mahalaga para sa diagnosis, nauri ayon sa kanilang katayuan at hugis ng Gram.

Hakbang 4. Kilalanin ang mga bacteria na positibo sa gramo batay sa kanilang hugis

Ang bakterya ay karagdagang naiuri ayon sa kanilang hugis sa ilalim ng mikroskopyo, pinaka-karaniwang bilang cocci (spherical) o rods (cylindrical). Narito ang ilang mga halimbawa ng bakterya na positibo sa gramo (may kulay na lila) ayon sa kanilang hugis:

Gram positibong cocci karaniwang staphylococci (nangangahulugang pangkat cocci) o streptococci (nangangahulugang chain cocci).
'Gram positive rods tulad ng Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, at Listeria. Ang rod bacteria na Actinomyces spp. karaniwang may mga sanga o filament.

Hakbang 5. Kilalanin ang gram negatibong bakterya

Ang mga bacteria na walang negatibong Gram (kulay rosas sa kulay) ay madalas na naiuri sa tatlong pangkat. Ang mga Cocci ay spherical sa hugis, ang mga rod ay mahaba at manipis, habang ang mga coccoid rod ay nasa pagitan.

Gram negatibong cocci Ang pinakakaraniwan ay Neisseria spp.
Mga rod-negatibong baras hal E. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, at marami pang iba. Ang Vibrio cholerae ay maaaring makita bilang isang regular na stem o isang baluktot na tangkay.
Gram-negatibong "coccoid" (o "coccobacilli") rod bacteria hal. Bordetella, Brucella, Haemophilus at Pasteurella

Hakbang 6. Maingat na suriin kung ang mga resulta ay halo-halong

Ang ilang mga bakterya ay mahirap na kulayan nang tumpak, dahil sa brittleness o waxy na likas na katangian ng kanilang mga dingding ng cell. Ang mga bakterya na ito ay maaaring magpakita ng isang timpla ng lila o rosas sa parehong cell, o sa pagitan ng iba't ibang mga cell sa parehong pahid. Ang mga sample ng bakterya na mas matanda sa 24 na oras ay maaaring ipakita ang problemang ito, ngunit mayroon ding ilang mga species ng bakterya na mananatiling mahirap kulayan sa anumang edad ng pag-sample. Ang mga bakteryang ito ay nangangailangan ng mas dalubhasang mga pagsubok para sa pagkakakilanlan, tulad ng mabilis na paglamlam ng acid, pagmamasid sa kultura ng bakterya, media ng TSI culture, o pagsusuri sa genetiko.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, at Propionibacterium spp. lahat ay bakterya na positibo sa gramo, ngunit madalas ay hindi malinaw na nabahiran.
Maliit, payat na bakterya tulad ng Treponema, Chlamydia, at Rickettsia spp. mahirap mantsahan ng pamamaraan ng Gram.

Hakbang 7. Itapon ang anumang natitirang magagamit at kagamitan

Ang pamamaraan ng pagtatapon ng basura na ito ay nag-iiba sa pagitan ng mga laboratoryo at nakasalalay sa mga ginamit na materyales. Karaniwan, ang likido sa stenting tray ay itinatapon sa mga bote na may label na mapanganib na basura. Magbabad ng mga slide sa 10% na solusyon sa pagpapaputi, pagkatapos ay itapon sa isang lalagyan ng sharps.

Mga Tip

Tandaan na ang mga resulta ng Gram stain ay magiging mabuti lamang kung ang sample ay mabuti. Mahalagang ipaalam sa mga pasyente upang makapagbigay sila ng isang mahusay na ispesimen (hal, ang pagkakaiba sa pagitan ng pagdura laban sa isang malalim na ubo upang makakuha ng isang sample ng plema).
Bilang isang kulay na pagpapaputi, ang etanol ay mas mabilis na tumutugon kaysa sa acetone.
Sumunod sa karaniwang mga regulasyon sa laboratoryo upang matiyak ang kaligtasan.
Gumamit ng cheek swab upang magsanay, dahil naglalaman ito ng parehong gram-positive at gram-negatibong bakterya. Kung makakita ka lamang ng isang uri ng bakterya, maaaring gumagamit ka ng masyadong kaunti o labis na pagpapaputi.
Maaari kang gumamit ng mga kahoy na clasps upang ma-secure ang slide.

Babala

Ang acetone at ethanol ay mga sangkap na nasusunog. Aalisin ng acetone ang langis mula sa iyong mga kamay, na ginagawang mas madali para sa iyong balat na tumanggap ng iba pang mga kemikal. Magsuot ng guwantes at gamitin ang mga ito nang may pag-iingat.
Huwag hayaang matuyo ang smear bago mo banlawan ang Gram stain o counterstain.